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干细胞治疗溃疡性结肠炎

发布时间:2014-11-18 23:02:29 点击浏览:次

干细胞治疗顽固性溃疡性结肠炎探讨

□济南军区总医院消化科 江学良

顽固性溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)指诱导或维持缓解治疗失败,通常为皮质激素抵抗或依赖的病例(《胃肠病学》,2007)。皮质激素抵抗是指泼尼松龙足量(0.75 mg·kg- 1·d-1)应用4周不缓解者。皮质激素依赖是指泼尼松龙减量至10 mg/d即无法控制发作(用药3月不能减至10 mg/d以下)或停药后3月复发者。对这些激素依赖或者抵抗的顽固性溃疡性结肠炎,如何寻找有效的治疗方法成为临床研究的难点和重点。近年来,干细胞的研究为溃疡性结肠炎治疗带来新希望。

干细胞治疗思路

由于溃疡性结肠炎主要以结肠粘膜弥漫性损害(炎症、糜烂、溃疡等)为特点,修复损伤的结肠粘膜是治愈该病的关键。正常情况下,结肠粘膜上皮是机体更新和修复较快的组织。为何在溃疡性结肠炎时机体就不能修复损伤的结肠粘膜呢?目前尚没有一个满意的解释。研究表明,结肠粘膜的再生和修复依赖于结肠粘膜干细胞。结肠粘膜干细胞位于结肠隐窝的底部(Pull SL,Doherty JM,Mills JC,et al.2005),数量极少,可分化为成熟的结肠粘膜细胞,维持结肠粘膜的生理更新,但对于结肠粘膜干细胞的来源尚不清楚。溃疡性结肠炎最典型的病理特点是大量隐窝坏死,形成脓肿,而结肠粘膜干细胞位于隐窝基底部,隐窝坏死导致原本极少的结肠粘膜干细胞进一步减少,无法再生和分化出足够的结肠粘膜上皮细胞以修复损伤的粘膜。由此,我们推测,结肠粘膜干细胞减少可能是导致粘膜损伤无法修复的重要原因。因此,如何补充足够的结肠粘膜干细胞就成为治疗该病的关键。

干细胞来源的选取及纯化方法

目前,增加结肠粘膜干细胞数目可能的途径有以下几种:第一种方法是分离鉴定成体结肠粘膜干细胞作为患者移植来源。但由于结肠粘膜干细胞缺乏高度特异的标记,分离、培养、鉴定都非常困难,完全依靠直接补充结肠粘膜干细胞在当前是不现实的(Stappenbeck TS,Mills JC,Gordon JI.2003)。第二种是将胚胎干细胞作为结肠粘膜干细胞的来源途径之一,但由于伦理学、免疫排斥和可能发生肿瘤、污染等因素限制了其应用(Hopkins Tanne J.2005)。第三种可能途径就是骨髓干细胞动员(Okamoto R,Yajima T,Yamazaki M,et al.2002)。因为骨髓干细胞是成体中最原始的细胞,有很强的发育潜能,除可发育分化为各种血细胞和免疫细胞外,还具有造血以外的发育潜能(Yoon YS,Wecker A,Heyd L,et al.2005),如分化为心肌细胞、肝细胞、神经细胞等。这些研究提示,成体组织干细胞可能来源于骨髓干细胞。骨髓干细胞在正常机体中循环,遇有组织更新或再生的需求,便停留下来,本地化为组织干细胞,以补充或更新内源组织干细胞库,随后进入增殖和分化程序,分化为成熟的组织细胞。即骨髓干细胞是成体中最原始的细胞,由其逐步分化为各组织干细胞,再增殖和分化为特化的组织细胞,符合经典的细胞分化概念(江学良,李兆申.2008)。研究还证实,体外扩增的自体骨髓干细胞回输给因中子照射引起多脏器衰竭的动物模型,经标记的骨髓干细胞可以在损伤的肠道、皮肤、肌肉中检测到,并且一直可以持续到82天后(Chapel A,Bertho JM,Bensidhoum M,et al.2003)。因此,骨髓干细胞也有可能随血液循环到达溃疡性结肠炎病变结肠粘膜,并分化为粘膜上皮细胞。另外,某些异体骨髓移植患者,发生移植物抗宿主反应形成结肠溃疡后的修复提示,供体来源的骨

髓干细胞重建了受体肠道的结肠粘膜上皮(Okamoto R,Watanabe M.2004),也就是说,在成体情况下,骨髓干细胞可能是结肠粘膜干细胞的来源。研究表明,合并白血病的溃疡性结肠炎患者,在骨髓移植后,停用免疫抑制剂仍可长期缓解、没有复发,进一步提示骨髓来源的干细胞可能对严重的结肠粘膜上皮细胞损伤修复具有重要意义(Ditschkowski M,Einsele H,Schwerdtfeger R,et al.2003)。

骨髓干细胞转分化为结肠粘膜干细胞的前提是外周血循环中要有足够量的骨髓干细胞,才能保证到达病变结肠粘膜并在结肠微环境中转化。生理情况下,外周血循环中骨髓干细胞数量很少,只能维持机体生理更新需要,当溃疡性结肠炎隐窝坏死严重导致原本极少的结肠粘膜干细胞大量减少时则无法满足需要。因此,如果利用骨髓干细胞动员剂——粒细胞集落刺激因子(annaki E,Athanasiou E,Xagorari A,et al.2005)大幅提高循环中的干细胞数量,随血循环到达病变结肠,在结肠微环境中,受诱导进行增殖和转分化为结肠粘膜干细胞和结肠粘膜上皮细胞,增强机体对病损粘膜的修复能力,促进溃疡愈合,恢复其正常的生理功能。而且,利用自体骨髓干细胞治疗时可不必进行结肠粘膜干细胞(数量少,缺乏特异标志)的分离和扩增,骨髓干细胞的增殖和转分化在结肠组织微环境中可自行完成。进行自体骨髓干细胞动员治疗溃疡性结肠炎,还将克服异体移植供体来源少和排斥反应的问题,相当于安全、方便的进行了骨髓干细胞的“自我移植”,临床意义重大,应用前景广阔。

但是这其中还有很多问题尚未明确,包括骨髓功能与溃疡性结肠炎病情轻重和预后是否有关,骨髓干细胞在溃疡性结肠炎发生过程中的变化规律,外周血和原位组织内影响干细胞定植和分化因子的改变等问题均未知,较为全面地揭示骨髓干细胞的作用机制为需要解决的核心问题。但如果采用异基因骨髓移植,需要配型、清髓和长期应用免疫抑制剂,风险大,费用昂贵,采用自体骨髓移植,由于溃疡性结肠炎患者往往合并骨髓病变,骨髓干细胞功能差。

为了避免由于溃疡性结肠炎病变影响骨髓干细胞功能,我们建议选用同种异基因脐带血干细胞作为治疗干细胞的来源,以保证干细胞的质量。首先,脐带血比骨髓更为原始。第二,脐带血的干细胞自我繁殖能力最强,繁殖速度最快,骨髓次之,外周血最差。脐带血中干细胞的比率最大,骨髓次之,外周血最低。外周血中的干细胞更接近终端细胞或叫祖细胞或前体细胞。而且,脐带血干细胞在用做细胞治疗时可以忽略HLA配型问题,就如同临床上输血一样,不用HLA配型。原因:①脐带血干细胞的表面抗原性很弱,弱到不被受体的免疫系统识别。②用于细胞治疗的脐血干细胞不替代原有的组织器官,原有的组织器官还在起作用。“细胞处理试剂盒”是经药监部门批准专门用于临床分离骨髓和脐带血中有核细胞的,其主要成分为蛋白酶和无机盐离子,是一种新型而简便的富集高纯度干细胞的方法,是世界上分离、纯化干细胞最优化的方法之一。其原理是以蛋白酶选择性地与非靶细胞结合,使非靶细胞表面活性发生变化,细胞密度发生了变化,通过密度梯度离心的方法分离获得所需的靶细胞,由于是负筛选,所以收集的靶细胞没有任何标记。一个试剂盒设计分离200 mL骨髓

通过合理利用干细胞类型、提高干细胞数量与质量、选择最有利的治疗途径、治疗前后给予各种干预措施以及提高干细胞定值及生存率等都是未来干细胞治疗溃疡性结肠炎的关键。

或200 mL脐带血,能有效全部除去红细胞、血小板、及去全部血浆物质,LIN抗体阴性,只回收有核细胞,分离纯化后的有核细胞回收率85%以上,细胞存活率98%以上,不损伤干细胞,干细胞表面无任何标记物,能完整地保持干细胞原有的生物学活性。

干细胞治疗的途径与方法

清髓法:有研究试用骨髓造血干细胞移植治疗顽固性炎症性肠病取得一定效果。但传统骨髓移植方法需要进行“清髓性”等处理,“清髓性”移植由于采用了大剂量的放/化疗作为预处理方案,使得移植过程存在很大风险,如:较长时间的严重的造血抑制可引起脑出血、肺出血,以及容易发生细菌/真菌败血症,往往导致患者早期死亡;大剂量的放疗(12Gy)不但容易引起放射性肺炎、肝静脉闭塞综合征、白内障等严重并发症,而且会影响到患者的生殖功能,造成年轻患者在移植后不孕不育。此外,移植物免疫抑制发生率高,且程度严重;患者在移植后免疫功能重建缓慢,易反复发生呼吸道感染、皮肤带状疱疹等;这些都严重影响到患者在移植后的生存质量。而且,对于年龄大于45岁、身体虚弱、合并有其他器官功能障碍的患者,应被排除在传统移植治疗的对象范围之外,但是临床上有相当一部分患者在发病时,年纪已经超过45岁,甚至更大。

非清髓法:笔者及所在研究团队设计的方案,治疗前后不用任何放疗或者化疗措施,直接从骨髓或者脐带血中提取干细胞(总数大于1.0×108个),经股动脉插管至肠系膜下动脉,缓慢注入,具有安全、方便、费用低廉等优点。

笔者采用加拿大威尔森公司研制的脐带血干细胞体外分离试剂盒,从脐带血中提取CD34+、CD117+、CD133+、C-kit+、Sca-1+干细胞(总数大于1.0×109个),经股动脉插管至肠系膜下动脉,缓慢注入,治疗11例激素抵抗型溃疡性结肠炎患者。干细胞随血循环到达病变结肠,在结肠微环境中,受诱导进行增殖和转分化为结肠粘膜干细胞和结肠粘膜上皮细胞,增强机体对病损粘膜的修复能力,促进溃疡愈合,恢复其正常的生理功能。临床初步观察表明,对激素抵抗型溃疡性结肠炎近期可以使患者临床症状缓解,结肠粘膜愈合,组织学改善,疾病活动指数降低,并逐渐停用皮质激素。无一例出现干细胞治疗相关的并发症,由于脐带血干细胞表面抗原性很弱,非清髓治疗时不需要做配型,避免了传统清髓治疗的风险,而且,干细胞的增殖和转分化在结肠组织微环境中可自行完成,不必进行结肠粘膜干细胞(数量少,缺乏特异标志)的分离和扩增,具有安全、方便的优点。脐带血干细胞数量多(总数大于1×108个),干细胞再生能力较骨髓干细胞强,临床治疗效果更好。对脐血干细胞在溃疡性结肠炎治疗中的作用机制需要更深入研究,从而为阐明溃疡性结肠炎粘膜损伤无法修复的原因及从根本上治疗该病提供新的思路(江学良,2009,2006.)。

需要进一步解决的问题

通过一系列临床和基础研究(江学良,2009),笔者发现非清髓脐带血干细胞治疗顽固性溃疡性结肠炎安全性高,患者易于接受,多数患者治疗后激素减量或者停用。但还有些问题需要进一步解决,如患者接受干细胞治疗的最佳时机;如何进行个体化治疗;是否对植入细胞进行细化;干细胞治疗后在机体内转分化过程和机制;治疗后疗效能持续多久等问题。通过合理利用干细胞类型、提高干细胞数量与质量、选择最有利的治疗途径、治疗前后给予各种干预措施以及提高干细胞定值及生存率等都是未来干细胞治疗溃疡性结肠炎的关键。

(本文作者系济南军区总医院消化科教授、主任医师、研究生导师。)



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